【補足】JISAIさんの「Gapdhの有無で生細胞を判定してしまっている問題点について」の参照先のコメント
Ooboeさんからご依頼のあった、JISAIさんの「Gapdhの有無で生細胞を判定してしまっている問題点について」の参照先のコメントを張りつけておきます（他の人の関係のないコメントは省略します）。
185. JISAI
2016年04月07日 13:36
- 2016年04月07日 17:09
- 185. JISAIさん
＞...
＞Gapdhの活性の測定だけで死細胞として除外するのは、実は検証実験としても無意味だったりします
これは、専門家として責任を持たれた発言ですか？ もしこのことが本当なら、専門家であるはずの検証チームの関係者は、同様の危惧を持ったはずです。ということは、無意味な検証実験と分かって行ったということになります。これが本当なら大変な問題です。素人の空想なら、今のうちにそう言ってください。
- 2016年04月07日 17:28
- >>185. JISAIさん
ESを１としながらもコントロールはなぜかmorulaですね。gapに適合してるんでしょうか。
- 2016年04月07日 18:01
- 検証実験の報告スライドの発現量のデータ（oct/gap のデータのグラフ）のATP1～ATP22と、小保方さんHPの ATP-No.1～ATP-No.5がどういう関係にあるのか私にも全く分かりませんでした。理研に全データを公開して欲しいです。
- 2016年04月07日 18:11
- >187.
まず私は素人で専門家ではありません。
185は、ネットで得た程度のGAPDHの基礎知識から判断した推測です。
素人考えですが、専門家であるはずの検証チームは、stap細胞が「生細胞」であると思い込んで、stap細胞が「死細胞」であっても構わないことに気付いていないように思えます。
(ただスライド資料のグラフが、ESを１とせずに、morulaを１としてコントロールもなぜかmorulaしかない（1410108cellの右隣りがes?)のは、ESがgap高発現で除外されることを分かっていそうですが）
>189.
再現実験でのGAPDHの使用目的は、
会見時の理研資料に
＞生細胞を判定するGapdh（ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）
とありますし、会見でも相澤氏がGapdhで生細胞のみを選別してグラフにしていると云われています（会見動画で確認してください)。
＞Oct4の発現量をGAPDHの発現量でノーマライズした
という特殊な使い方をしているようには思えませんが
- 2016年04月07日 18:28
- それから、丹羽氏の検証実験の方では、GAPDHによる生細胞の検出は行っていないようです。やはり変ですね。
- 2016年04月07日 18:43
- 193.J・ワトソンさん
morulaは桑実胚で、もしESをコントロールにしているのなら、小保方HPのグラフのようにESも並記していると思うのですが
- 193.J・ワトソンさん
- 2016年04月08日 03:04
- 192. J・ワトソンさん
丹羽先生による検証実験の結果スライドでは、gapという文字は出てきていませんでしたが、実験をまとめた論文
http://biorxiv.org/content/biorxiv/early/2015/09/28/027730.full.pdf
を見ると、QPCRの結果はすべてGAPDHの発現量でノーマライズされた値だと書いてありました。少なくとも189.は丹羽先生のデータに関しては正しいようです。
方法の項目より "All samples were tested in triplicate, and the mean relative amounts of each transcript were calculated by normalization to an endogenous control Gapdh."
- 192. J・ワトソンさん
- 2016年04月08日 03:10
- 191. JISAIさん
GAPDHの生物学的な解釈については了解しました。実験に用いた目的については、丹羽先生のデータに関してはノーマライズの目的で用いられていたようです（197.）。会見での相澤先生の説明についてはちょっと記憶が曖昧なので、また暇なときに確認してみます。
- 2016年04月08日 03:25
- ＞197. 特命
誤解を招かないように書いておきますが、丹羽先生の論文は、草稿段階のものです（査読を経ていない）。しかし、丹羽先生による検証実験の内容を理解するのには役立つと思います。細胞塊の美しい写真も載っています。
- 2016年04月08日 07:44
- 197. 特命さん
＞QPCRの結果はすべてGAPDHの発現量でノーマライズされた値だと書いてありました。少なくとも189.は丹羽先生のデータに関しては正しいようです。
話をずらしてはいけませんよ。丹羽氏の論文のどこにもGAPDHを生細胞の検出に使ったなどとは書いてありませんよ。おかしいじゃないですか？相澤氏が、小保方氏のPCRについては生細胞の検出に使って細胞を選別したと言っていることは紛れもない事実です。
それに、GAPDHをRT-PCRのコントロールとして使用するのが普通のことならば、小保方氏のPCRでもそれはやっている可能性もありますよ。当たり前だから書いてないだけかも。しかし、生細胞の検出に使うなどということは、小保方論文でも丹羽氏の検証実験でもやっていませんね。
それに、小保方氏HPのPCRデータは丹羽氏のデータに非常に近いのです。理研が発表したデータとは全く違います。GAPDHというコントロールの有無だけでこれだけ違ってしまったのか？むしろ、まったく違う方法の解析を行ったから異なってしまった可能性の方が高いのでは？
- 2016年04月08日 10:10
- http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/products/product/pcr/archives/2006/09/rtpcr.html
TOYOBO RT-PCR Primer Sets
RT-PCR解析におけるコントロールとして頻繁に使用されるβ-actin、及びG3PDH遺伝子の増幅用プライマーとポジティブコントロールDNAのセットです。β-actin、G3PDHはどの組織でも発現しているハウスキーピング遺伝子であり、RT-PCRのコントロールとして良く使用されます。
＊＊
私もRT-PCRを少しだけやったことがあるのですが、業者に注文すると小さな箱が来てその中に試薬から何から全部セットしたものが入っているんですよ。完全にキット化されていてマニュアル通りやるだけです。コントロールもたしかβ-actinを使った記憶があります。そんなのやってないわけないですね。
- 2016年04月08日 10:18
- 丹羽先生の検証実験は
1.脾臓、肝臓、心臓由来の細胞から297回の塩酸orATP処理を行ったところ細胞塊の出現は確認できた。
2・ATP処理した細胞塊ではOct3/4タンパク質の存在も認められたが、受精卵に注入したところ緑色蛍光を発するものは0だった。
3.stap幹細胞の樹立については、細胞塊492個のうち3例で増殖性は見られたが、継代できずSTAP幹細胞は樹立できなかった。
これが全てです。
また、完全な周回遅れで「丹羽氏は、STAP細胞が存在しないと説明できない現象があると言っていた」とか言ってる人がいますが、丹羽先生はあくまでも論文のデータを真実としたうえでそのような発言をしたわけです。そういう現象があるというのは論理的な帰結なんだと。
そして、そのデータが信じられるかどうかを検証したところ、信じられる結果が得られなかった為、特命さんが紹介された丹羽先生の論文には“As a result, we have concluded that the STAP phenomenon as described in the original studies is not reproducible.”と書いてあるのです。
現時点でこれよりも明らかになっていることはありません。ついでに言えば、このブログにいる人達が、若山先生や遠藤先生、分生学会をどう批判しようとも、この結論は変わりませんから。
- 2016年04月08日 11:18
- ＞the STAP phenomenon as described in the original studies is not reproducible
ですから、STAP現象については、論文に書かれているような高い頻度では確認できなかったということですよ。一部の細胞塊には自家蛍光では説明できない現象が観察されています、このことは否定できません。
- 2016年04月08日 11:49
- >一部の細胞塊には自家蛍光では説明できない現象が観察されています、このことは否定できません。
調査委員会の帰結は違います。
・Oct‐GFPを導入した新生児脾臓、肝臓からのGFP 陽性細胞の出現頻度は低く、再現性をもって、これらの細胞の多能性獲得、未分化性を分子マーカーの発現によって確認することは出来なかった。
・細胞塊が有する緑色蛍光を自家蛍光と区別することも困難で、その由来を判定することは出来なかった。
http://www3.riken.jp/stap/j/e3document9.pdf
- 2016年04月08日 12:22
- 207. えりさん
＞調査委員会の帰結は違います。
不適切な帰結ですね。
- 2016年04月09日 08:05
- 多能性細胞における解糖系の亢進についてはJISAIさんのおっしゃる通りのようです。わかりやすい解説を見つけました。
＊＊
http://www.ohnos.org/cgi-bin/imode_mame.cgi?no=891&reno=541&oya=147&mode=msgview&list=new
興味深いことに、多能性幹細胞であるES細胞においても、その代謝は解糖系に依存するという特徴がある。また、iPS細胞の樹立において多能性を獲得する初期化の過程においては、ミトコンドリア代謝から解糖系を中心とした代謝への移行がみられ、iPS細胞もES細胞と同様に解糖系への依存性を示す。
つまり、多能性を獲得する初期化の過程において、代謝についてもリプログラミングが起こり、解糖系に依存する代謝の変化は多能性マーカーの発現にさきだって起こることが知られている。
＊＊
つまり、多能性を獲得していく過程にあるSTAP細胞において、解糖系の代謝亢進がおこりGAPDH等の解糖系関連酵素の発現が亢進するのは当たり前のことですね。ですから、この酵素の発現が亢進している細胞を死細胞として除外した理研の判断には科学的な正当性がないということです。
- 2016年04月09日 10:34
- 動物の細胞が生きていくためには、ブドウ糖を分解してエネルギーを取り出すことが必要です。
ブドウ糖を分解する代謝経路には、酸素が十分ある状態での好気性解糖と低酸素状態での嫌気性解糖という二つがあります。STAP細胞のように瀕死のストレス下にある細胞においては好気性解糖が機能しないために、嫌気性解糖が亢進してなんとかエネルギーを作り出そうと懸命に頑張っているのでしょう。
その解糖系によって作り出されるエネルギーがまさにATP（アデノシン3リン酸）という分子なんですが、嫌気性解糖だけでは十分な量のATPができない。ですから、STAP細胞を作製する上で、大量のATPを加えることが効果的であるということは、非常に合理的な話だと思いますね。
会見によると、Gapdh（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）の有無で生細胞を判定し、oct4有意の247中の57個のみ選別したそうです。
Gapdhは、細胞傷害を受けたときに細胞内から放出される酵素で、その活性の測定で、細胞毒性か細胞生存性かを判定して、細胞毒性が高い＝死細胞だから除外されたようで。
しかしGapdhは、解糖系/糖新生を構成する酸化還元酵素で、糖代謝経路が活性化した際の酵素であって、細胞傷害等による低酸素によって発現が充進するだけでなく、細胞の代謝が解糖系に活性化しても高発現になるわけで、
多能性幹細胞(ES,ips)や各種幹細胞･造血幹細胞･癌細胞等での未分化性を維持する段階では、分化した細胞とは異なる解糖系の代謝を保持して活性化していることからすると、stap細胞でも同様に解糖系の代謝が活性化していると考えられるわけで、
Gapdhの活性の測定だけで死細胞として除外するのは、実は検証実験としても無意味だったりします